Research Article
Andraž Dolar1*, Jernej Ogorevc2,
Anita Jemec Kokalj1
1 University in Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of
Biology, Večna pot 111, SI-1000 Ljubljana
2 University in Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Zoology,
Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana
* Dopisni avtor
Citiranje: Dolar, A., Ogorevc, J. &
Jemec Kokalj, A. (2023). Vpliv simptomatske bakterijske okužbe na izražanje
genov, povezanih z imunostjo v hemocitih kopenskega raka Porcellio scaber. Acta Biologica Slovenica, 66(2).
Doi: https://doi.org/10.14720/abs.66.2.14428
Izvleček
Kopenski enakonožci vrste Porcellio scaber so v naravnem okolju
izpostavljeni številnim patogenom in parazitom, ki lahko pri gostitelju
povzročijo poškodbe tkiv ter vplivajo na imunokompetenco in fitnes organizma.
Bakterijska okužba povzroči aktivacijo mehanizmov prirojene imunosti, kot so
fagocitoza, tvorba reaktivnih kisikovih in dušikovih zvrsti, aktivnost
antioksidativnih encimov, nodulacija ter proces melanizacije. Molekularni
vzorci patogenov oziroma mikrobov ter s patogenezo povezane poškodbe pri
gostitelju sprožijo prepisovanje genov v celicah hemolimfe, tj. hemocitih, ki
opravljajo pomembno funkcijo mediatorjev imunskega odgovora. V aktualni
raziskavi smo preučevali spremembe v izražanju genov ob simptomatski
bakterijski okužbi z Rhabochlamydia porcellionis ter jih primerjali z
asimptomatskimi oziroma zdravimi P.
scaber. Iz hemolimfe (hemocitov) asimptomatskih in simptomatskih živali smo
izolirali celokupno RNA, jo prepisali v cDNA ter z metodo RT-qPCR določili
relativno izražanje izbranih genov, povezanih z imunostjo (Toll4, Dscam,
MyD88, Cat, MnSod, CypG, A2m, Atg5 in Nos). Ugotovili smo značilne
spremembe v izražanju izbranih genov, kar kaže na njihovo vlogo v imunskem
odgovoru P. scaber v primeru
bakterijske okužbe, dodatno pa smo z biokemijskimi metodami dokazali povečano
aktivnost encima alfa-2-makroglobulin ter mejno značilno povišanje encima
katalaza. Na podlagi rezultatov lahko zaključimo, da preučevani geni
predstavljajo molekularne označevalce za imunski odziv, ki jih je moč uporabiti
v različnih okoljskih raziskavah.
Ključne besede
bakterijska okužba, imunski odziv,
izražanje genov, kopenski enakonožec Porcellio
scaber, Rhabdochlamydia porcellionis
Effect
of symptomatic bacterial infection on the expression of immune-related genes in
haemocytes of the terrestrial crustacean Porcellio
scaber
Terrestrial isopods Porcellio scaber
are exposed to many pathogens and parasites in their natural environment, which
can cause tissue damage in the host and affect the immunocompetence and fitness
of the organism. Bacterial infection leads to activation of innate immunity
mechanisms, such as phagocytosis, formation of reactive oxygen and nitrogen
species, activity of antioxidant enzymes, nodule formation, and the process of melanization. Molecular patterns of pathogens or microbes
and pathogenesis-induced injury in the host trigger the transcription of genes
in haemolymph cells, i.e., haemocytes, which have an important function as
mediators of the immune response. In the current study, we examined changes in
gene expression during symptomatic bacterial infection with Rhabochlamydia
porcellionis and compared them with asymptomatic
or healthy P. scaber.
We isolated total RNA from the haemolymph (haemocytes) of asymptomatic and
symptomatic animals, transcribed it into cDNA, and determined the relative
expression of selected immune-related genes (Toll4, Dscam,
MyD88, Ppae2a, Cat, MnSod, CypG,
A2m, Atg5, and Nos). We found characteristic changes in the
expression of selected genes confirming their role in the immune response of P. scaber in
case of bacterial infection, and, in addition, biochemical methods showed
increased activity of the enzyme alpha-2-macroglobulin and a borderline
characteristic increase in the enzyme catalase. Based on the results, we can
conclude that the studied genes represent molecular markers of immune response
that can be used in various environmental studies.
Keywords: bacterial
infection, gene expression, immune response, terrestrial isopod Porcellio scaber,
Rhabdochlamydia porcellionis
Uvod
Navadni prašiček Porcellio scaber
(Latreille, 1804) je predstavnik enakonožnih rakov, ki poseljujejo naravne
habitate centralne in zahodne Evrope, hkrati pa so izrazito sinantropna vrsta,
kar pomeni, da so tesno povezani s človeškimi bivališči in njegovo dejavnostjo.
Znotraj skupine rakov so enakonožci najuspešnejši kolonizatorji kopenskega
okolja, ki so tekom prilagajanja na kopensko življenje razvili številne
vedenjske, fiziološke in strukturne lastnosti (Hornung, 2011). V ekosistemu
opravljajo pomembno vlogo razkrojevalcev odmrlega organskega materiala, s čimer
prispevajo h kroženju snovi v naravi in so tako nepogrešljiv člen talnega
ekosistema (Hornung in sod., 1998; van Gestel in sod., 2018). V okolju so
kopenski enakonožci, podobno kot tudi ostali organizmi, podvrženi različnim
nevarnostim, kot so patogeni in paraziti. Znano je, da virusne in bakterijske
okužbe pogosto prizadenejo naravne populacije višjih rakov (Wang, 2011). V
naravni populaciji kopenskih rakov P. scaber pogosto zaznamo
Iridovirusno IIV-31 okužbo, ki je izražena pri 15-20 % osebkov naravne
populacije (Cole in Morris, 1980), medtem ko je prevalenca okužbe z bakterijo Rhabdochlamydia
porcellionis še višja, in sicer dosega 27 % (Kostanjšek in Pirc Marolt,
2015). Bakterijo R. porcellionis (družina Rabdoklamidij) uvrščamo v
skupino patogenih, obligatno znotrajceličnih bakterij, imenovanih klamidije, s
širokim naborom gostiteljev, tako med vretenčarskimi kot tudi nevretenčarskimi
organizmi (Kostanjšek in sod., 2004; Halter in sod., 2022). Pri P. scaber
je okužba z R. porcellionis primarno omejena na celice prebavne žleze
hepatopankreas, na površini katere v simptomatski fazi okužbe opazimo bele
lise, od tod pa se okužba lahko razširi tudi na druga tkiva, med drugim tudi v
hematopoetsko tkivo in pa celice hemolimfe, tj. hemocite (Kostanjšek in Pirc
Marolt, 2015). V hemolimfi P. scaber s simptomatsko R. porcellionis
okužbo pride do oblikovanja izrazitega imunskega odgovora, kar se kaže v
drastični spremembi vrednosti imunskih parametrov hemolimfe, v primerjavi z
asimptomatskimi živalmi (Kostanjšek in Pirc Marolt, 2015; Dolar in sod., 2020).
Gostiteljski organizmi se na vdor patogenov, parazitov in na poškodbo odzovejo
z aktivacijo nabora mehanizmov prirojene imunosti, katerih glavni namen je
ponovna vzpostavitev stabilnega notranjega ravnovesja (tj. homeostaza) ter
preprečitev nadaljnjih poškodb oziroma smrti organizma (Wang in Wang, 2013;
Mengal in sod., 2023). V tem pogledu simptomatska bakterijska okužba, ki je
prisotna v naravni populaciji P. scaber predstavlja dostopen in enostaven
model za študije posameznih komponent in mehanizmov prirojene imunosti v luči
odkrivanja novih bioloških označevalcev, ki jih je moč prenesti v okoljske
raziskave z namenom ocene stanja organizma po izpostavitvi različnim okoljskim
onesnažilom, kot so recimo kemikalije in umetnimi delci, npr. nano- in
mikroplastika (Dolar in sod., 2021, 2022b,c; Jemec Kokalj in sod., 2021, 2022).
Prirojen imunski sistem kopenskega
enakonožca P. scaber je odgovoren za prepoznavanje in odzivanje na
raznovrstne zunanje in notranje »izzivalce« (npr. patogene, parazite, poškodbe,
okoljske spremembe), ki lahko resno ogrozijo zdravje in v skrajnem primeru
povzročijo tudi smrt organizma (Dolar in sod., 2020, 2022a,b,c). Imunski
odgovor gostitelja na mikrobno okužbo temelji na evolucijsko ohranjenih
efektorskih mehanizmih celične in humoralne komponente prirojene imunosti, kot
so fagocitoza, nodulacija in enkapsulacija, proces melanizacije in produkcija
ter sproščanje drugih humoralnih molekul, npr. reaktivnih kisikovih (ROS) in
dušikovih spojin (RNS) ter antimikrobnih peptidov (Jiravanichpaisal in sod.,
2006; Söderhäll, 2016). V hemolimfi P. scaber so prisotni trije glavni
tipi celic hemolimfe oziroma hemociti, tj. semigranularni, granularni in
hialini, ki opravljajo specifične naloge tekom imunskega odgovora, pri čemer so
hialinociti v splošnem odgovorni za fagocitozo, delno tudi semigranulociti,
medtem ko pa so semigranulociti in večinsko granulociti odgovorni za produkcijo
in sekrecijo različnih humoralnih molekul v hemolimfo in oblikovanje
humoralnega imunskega odgovora (Tassanakajon in sod., 2013, 2018). Bakterijska
okužba pri rakih izzove značilne spremembe v celokupnem (angl. total haemocyte
count) kot tudi diferencialnem številu (angl. differential haemocyte count)
hemocitov (Dolar in sod., 2020). Hkrati lahko bakterijski toksini, kot je
endotoksin lipopolisaharid, poškodujejo hemocite in povzročijo njihov propad,
kar se odrazi v zmanjšani viabilnosti hemocitov (Dolar in sod., 2022a). Slednji
pojav je povezan tudi s povečano fagocitotsko aktivnostjo hemocitov (hialinih
in semigranularnih) in tvorbo ROS ter RNS (npr. dušikov oksid; NO) z namenom
razgradnje fagocitiranih tujkov (Raman in sod., 2008; Sánchez-Salgado in sod.,
2019). Povečana proizvodnja reaktivnih spojin v primeru mikrobne okužbe v
hemolimfi rakov posledično izzove tudi povečano aktivnost encimov superoksid
dismutaze in katalaze, ki sta odgovorna za odstranjevanje presežka reaktivnih
spojin (Gopalakrishnan in sod., 2011; Liu in sod., 2013). Histopatološke
poškodbe, ki jih povzročajo patogene bakterije, lahko prizadenejo tudi ostala
tkiva in organe gostitelja, med drugim tudi eksoskelet, kar še dodatno poveča
tveganje za vdor novih patogenov v organizem (Esteve in Herrera, 2000;
Chevalier in sod., 2011; Wang, 2011; Kostanjšek in Pirc Marolt, 2015). Poškodba
tkiva sproži aktivacijo sistema profenoloksidaze (proPO), kaskado dogodkov in
komponent, med katerimi ima terminalno vlogo encim fenoloksidaza (PO), ki
katalizira proces sinteze rdeče-rjavega pigmenta melanina, ki skupaj s hemociti
fizično omeji tujke v telesu gostitelja (t. i., nodulacija ali enkapsulacija),
medtem ko stranski produkti melanizacije (kinoni, ROS, RNS) delujejo toksično
in povzročijo lizo mikrobnih celic (Amparyup in sod., 2013). Pomembna
komponenta proPO sistema je tudi serinski proteinazni inhibitor alfa-2
makroglobulin, ki se aktivira ob prisotnosti mikroorganizmov ter regulira
fenoloksidazno aktivnost, poleg tega pa je vpleten tudi v proces strjevanja
hemolimfe ter fagocitoze (Ponprateep in sod., 2017).
Vdor patogena v telo oziroma poškodba
gostitelja v prvi vrsti povzroči aktivacijo receptorskih molekul, ki se
nahajajo v plazmi hemolimfe oziroma na površini hemocitov, sledi signalna
transdukcija, tj. kaskada dogodkov, ki privede do sprememb v profilu izražanja
genov, ki so posredno ali neposredno povezani z imunostjo in drugimi procesi,
odgovornimi za uravnavanje homeostaze (Sánchez-Salgado in sod., 2021; Liu in
sod., 2022). V fizioloških in funkcionalnih raziskavah genov in molekul, ki so
odgovorni za imunske mehanizme v primeru mikrobne okužbe gostitelja se
uporablja napredne omske metode, te metode pa v okoljskih raziskavah odpirajo
povsem novo ero v raziskovanju vplivov različnih onesnažil in okoljskih
sprememb na poskusne organizme (Lou in sod., 2022; Sun in sod., 2022; Mengal in
sod., 2023).
Namen študije je bil preučiti izražanje
izbranih genov, povezanih z imunostjo, v hemocitih P. scaber s
simptomatsko okužbo z Rhabdochlamydia porcellionis. Izražanje genov smo
primerjali z asimptomatskimi osebki P. scaber. Poleg tega nas je
zanimala tudi razlika v aktivnosti encimov alfa-2-makroglobulin ter katalaza v
primeru simptomatskih in asimptomatskih živali.
Material in metode
Poskusni organizem
Poskusni
organizmi P. scaber so bili izbrani
iz laboratorijske kulture, ki smo jo gojili v steklenih terarijih pri
konstantnih pogojih, tj. temperaturi 20 ± 2 °C, visoki vlažnosti in dnevno
nočnem režimu (16/8 ur : svetloba/tema). Stekleni terarij je bil napolnjen z
ne-kontaminirano zemljo in debelo plastjo posušenih listov navadne leske (Corylus avellana), ki so bili predhodno
sterilizirani. Za analizo izražanja genov so bili odbrani poskusni organizmi z
izraženimi simptomatskimi belimi lisami na prebavnih žlezah, ki jih je mogoče
opazovati neposredno skozi ventralno stran telesa, kot je opisano v Kostanjšek
in Pirc Marolt (2015) ter Dolar in sod. (2020). Odbrane živali so imele
prisotne značilne simptome bakterijske okužbe z Rhabdochlamydia porcellionis (Sl.
1). Živali brez izraženih simptomov okužbe z R. porcellionis (asimptomatske živali) smo uporabili kot kontrolo,
kot je opisano v Dolar in sod. (2020).
Slika 1:
(A) Simptomatska bakterijska okužba z R.
porcellionis v prebavni žlezi P.
scaber, razvidna z ventralne strani skozi sternite organizma. (B, C)
Simptomi okužbe, tj. značilne drobne bele pike (rdeča puščica) v celicah
prebavne žleze hepatopankreas.
Figure 1: (A) Symptomatic bacterial R. porcellionis infection in the
digestive gland of P. scaber
seen from the ventral side through the sternite of the organism. (B, C)
Symptoms of infection, i.e., characteristic small white dots (red arrow) in the
cells of the digestive gland hepatopancreas.
Izolacija hemolimfe
Aktivnost encima katalaza
Aktivnost
encima katalaza (CAT) smo v hemolimfi P.
scaber določili fotometrično z meritvijo razgradnje vodikovega peroksida (H2O2).
Izolirano hemolimfo (5 µL) smo nemudoma razredčili v 65 µL 50 mM
kalij-fosfatnega pufra (KP, pH= 7) z dodano 5 mM EDTA. Za meritev smo uporabili
UV mikrotiterske plošče s 96 vdolbinicami. V vdolbinico na plošči smo
odpipetirali 20 µL redčene hemolimfe, 30 µL KP pufra s 5 mM EDTA in nemudoma
pred meritvijo dodali še 100 µL 15,18 mM H2O2,
pripravljenega v 50 mM KP pufru (pH = 7) z dodano 5 mM EDTA. Reakcijski volumen
smo pred meritvijo 5-krat premešali s pipeto. Absorbanco smo merili pri 240 nm
in 25 °C, 3 minute s 30-sekundnim intervalom med zaporednimi meritvami, na
mikročitalcu Cytation 3 imaging reader (Biotek, ZDA). Kot negativno kontrolo
smo uporabili 50 mM KP pufer (pH= 7) s 5 mM EDTA. Aktivnost CAT smo izračunali
kot spremembo absorbance, merjene pri 240 nm na minuto na mg proteinov (ΔA240nm
min-1 mg proteinov-1).
Aktivnost encima alfa-2-makroglobulin
Aktivnost
encima alfa-2-makroglobulin (A2M) smo v vzorcih hemolimfe P. scaber določili fotometrično z meritvijo absorbance pri 405 nm.
Izolirano hemolimfo (5 µL) smo redčili v razmerju 1 : 15 (v/v) s pufrom DPBS
(pH 7,1–7,5), dobro premešali in do uporabe shranili na ledu. K 50 µL
razredčenega vzorca hemolimfe smo dodali 50 µL tripsina (1 mg/mL DPBS, Sigma)
in inkubiral 10 min pri 37 °C na toplotnem mešalu Thermomixer compact
(Eppendorf). K reakcijski mešanici smo dodali 20 µL sojinega tripsinskega
inhibitorja (2 mg/mL DPBS, Sigma) in znova inkubirali 15 min pri 37 °C. Nato
smo dodali še 250 µL N-benzoil-DL-arginin-pnitroanilida (BAPNA; 0,5 mg/L DPBS,
Sigma), ki smo ga pripravili s 100-kratnim redčenjem založne raztopine BAPNA
(50 mg/mL dimetil sulfokida; DMSO) v pufru DPBS. Sto µL reakcijske mešanice smo
v treh ponovitvah prenesli na mikrotitersko ploščo s 96 vdolbinicami in 30 min
merili absorbanco z mikročitalcem Cytation 3 imaging reader (Biotek, ZDA) pri
405 nm in 37 °C. Aktivnost A2M v vzorcu hemolimfe smo merili posredno preko
detekcije aktivnosti tripsina. Aktivnost A2M smo izrazili kot spremembo
absorbance pri 405 nm na minuto na mg proteinov (ΔA405nm min-1
mg proteinov-1).
Izolacija RNA in prepis v cDNA
Celokupno
RNA smo izolirali iz hemocitov v skladu z modificiranim protokolom z uporabo
kita RNeasy Plus Micro (Qiagen, Nemčija). Za simptomatsko in asimptomatsko
skupino smo izolirali skupno 3 neodvisne vzorce RNA, pri čemer je vsak vzorec
predstavljal biološko ponovitev. Združeni vzorec hemolimfe smo homogenizirali v
600 µL pufra RTL Plus in 30 sekund močno stresali, nato pa ga prenesli na gDNA
odstranjevalno kolono, ki smo jo postavili v 2 mL zbiralno plastično epruveto,
in centrifugirali 15 sekund pri 12.000 obratih na minuto (Eppendorf Minispin
centrifuga). Eluatu smo dodali enak volumen 70 % etilnega alkohola (EtOH) in
vse skupaj prenesli v RNeasy MinElute kolono, nameščeno v 2 mL zbiralno
palstično epruveto, ter centrifugirali 15 sekund pri 12.000 obratih na minuto.
Vsi nadaljnji koraki centrifugiranja, vključno s prejšnjimi, so bili izvedeni
pri sobni temperaturi (20–25 °C) in pri 12.000 obratih na minuto. Eluat smo
zavrgli in nadaljevali s čiščenjem vzorca z dodajanjem pufrov RW1 in RPE ter 15
sekundnim centrifugiranjem, oziroma dodatkom 80-odstotnega EtOH in 2 minutnim
centrifugiranjem. V nadaljevanju smo zbiralno plastično epruveto zamenjali z
novo in kolono ponovno centrifugirali, tokrat 5 minut. Celokupno RNA smo
izolirali iz RNeasy MinElute kolone z dodajanjem 14 µL vode brez RNaz in
centrifugiranjem 1 minuto v novo sterilno mikrocentrifugirko. Izolirano RNA smo
do uporabe hranili (na hladnem) pri -70 °C. Količino in kakovost izolirane RNA
smo preverili s fluorometrom Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) z uporabo
kita RNA HS Assay (Qiagen, Nemčija) in Tape Station 4100 (Agilent technologies,
ZDA). Iz 35 ng izolirane RNA smo pripravili komplementarno cDNA z uporabo
kompleta reagentov za reverzno transkripcijo (A3500; Promega, Wisconsin, ZDA),
v skladu z navodili proizvajalca (Sl. 2).
Skupni reakcijski volumen sintetizirane cDNA je bil 20 µL. Do uporabe smo cDNA
hranili (na hladnem) pri -20 °C.
Slika 2. Shema analize
izražanja genov, povezanih z imunostjo, v hemocitih P. scaber.
Figure 2. Scheme of analysis of immune-related gene expression in P. scaber
haemocytes.
Izbor kandidatnih genov povezanih z imunostjo začetnih oligonukleotidov
Kandidatni
geni, ki igrajo vlogo v imunskem sistemu rakov (Cat, katalaza; MnSod,
mangan superoksid dismutaza; Nos,
sintaza dušikovega oksida; CypG,
ciklofilin G; Dscam, celična
adhezijska molekula Downovega sindroma; Toll4,
toll-u podobni receptor 4; MyD88,
mieloidni diferenciacijski faktor 88; Ppae2a,
profenoloksidaza aktivacijski encim 2a; A2m,
alpha-2-makroglobulin; Atg5,
avtofagni protein 5) so bili izbrani zaradi njihove nepogrešljive vloge pri
delovanju prirojenega imunskega sistema rakov oziroma drugih nevretenčarjev in
so pogosto preučevani in diferenčno izraženi v primeru izpostavitve različnim
stresorjem (Chevalier in sod., 2012; Tassanakajon in sod., 2013; Clark in
Greenwood, 2016; Sun in sod., 2020). Poleg genov povezanih z imunostjo smo
uporabili tudi dva referenčna gena, tj. faktor raztezka 2; Ef2 in beta aktin; β-Act.
Zaporedja genov (kandidatnih in referenčnih) smo pridobili iz podatkovne zbirke
NCBI za druge skupine rakov. Z uporabo orodja BLAST (Discontiguous Megablast in
BLAST; E-vrednost < 1e-5) za prepoznavanje podobnih zaporedij smo jih
primerjali s transkriptomom P. scaber.
V ta namen smo uporabili transkriptom kopenskega raka P. scaber (Dolar in sod., 2022d), kot tudi dodatni transkriptom, ki
je prosto dostopen v podatkovni zbirki NCBI (referenčna številka: SRX2600493;
Becking in sod., 2017). Zaporedja začetnih oligonukleotidov za referenčne gene
in gene, povezane z imunostjo, so bila zasnovana s programsko opremo Geneious
Prime 2022.0.1 (Biomatters, Nova Zelandija) in sintetizirana pri komercialnem
ponudniku IDT (Coralville, ZDA) (Tabela 1).
Tabela 1. Podatki o začetnih oligonukleotidih, ki smo jih uporabili v analizi RT-qPCR
Table 1. Data on primers used in RT-qPCR analysis.
Gen |
Začetni oligonukleotidi (5′ –> 3′) |
Velikost produkta (bp) |
Referenčna št. |
β-Act |
F: CGGACGTACCACTGGTATCG |
264 |
KY780298.1 |
R: GAGGAGGCTGCAGTTGTCAT |
|||
Ef2 |
F: CGACAAAGGAAGGTGTTCTC |
101 |
FQ896398 |
R: ACCACCTCCACGATGAATA |
|||
Cat |
F: ATT GGA GAG CGA GGT CCT CT |
316 |
KC668411.1 |
R: TGT TCC CGA CCA AAT CCC AG |
|||
MnSod |
F: TCACCCAATGGTGGAGAA |
117 |
MF289344.1 |
R: TGATCCTTGAACAGCAACAG |
|||
Nos |
F: CCGTCAGCACTAGGTTTATC |
102 |
GQ865598 |
R: GGTCCACCTACTTGCATTT |
|||
CypG |
F: GAGATGGTACTGGAGGAAGA |
102 |
EU216759.1 |
R: CAGCATTAGCCATTGAAAGC |
|||
Dscam |
F: GTCCTTGCGTTCACTTCT |
86 |
JX679085 |
R: GTTGGAGCCTCTGGAATATC |
|||
Toll4 |
F: GAGATCCGAAGTATAGGTTATGC |
101 |
MF124331 |
R: AGTCCTCCTGCTGTTGT |
|||
MyD88 |
F: TGATTCTCTTCGCTGACAAA |
115 |
FQ906745.1 |
R: CTCAGACCACCAACCATATC |
|||
Ppae2a |
F: ACTACCCTAAGCCAGTGAA |
114 |
FJ620685.1 |
R: CTCCAAATTGAGTCTGTGTTATG |
|||
A2m |
F: AAATGACGAATCGGGATCTAC |
115 |
KJ540280 |
R: CAACCATTCCCTCGTTATGT |
|||
Atg5 |
F: AGC TTT GGA CAG GCT TGT GT |
261 |
KP317125.1 |
R: ACG GTG GTT CAA TGC CTT GA |
Analiza izražanja genov
Reakcija
RT-qPCR je bila izvedena v volumnu 10 µL z uporabo GoTaq qPCR Master Mix
(Promega, ZDA). V reakcijski volumen smo dodali 5 µL reagenta GoTaq® qPCR
Master Mix, 1,25 µL F začetnega oligonukleotida (5 µM) in 1,25 µL R začetnega
oligonukleotida (5 µM) in 2,5 µL vzorca cDNA (5-krat razredčenega v vodi brez
nukleaz). Reakcije RT-qPCR so bile izvedene na plošči s 384 vdolbinicami
(MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Applied Biosystems™), z uporabo
sistema PCR v realnem času ViiA 7 (Applied Biosystems, ZDA) z naslednjim
profilom cikla: 3 minute pri 95 °C in 40 ciklov (15 s pri 95 °C , 25 s pri 60
°C in 35 s pri 72 °C) , čemur je sledila določitev (talilne) krivulje. Vse
reakcije kot tudi negativna kontrola brez dodane matrice (cDNA) so bile izvedene
v treh tehničnih ponovitvah. Izražanje genov smo normalizirali z uporabo dveh
referenčnih genov, tj. Ef2 in β-Act, ki imata stabilno izražanje in
sta bila uporabljena v podobnih študijah pri drugih rakih (Chevalier in sod.,
2012; Xu in sod., 2020). Učinkovitost pomnoževanja začetnih oligonukleotidov
kandidatnih genov smo določili s pripravo redčitvene vrste cDNA in validacijske
krivulje. Relativno izražanje kandidatnih genov je bilo izračunano po metodi 2–ΔΔCt,
ki temelji na qPCR učinkovitosti za izbrane začetne oligonukleotide, ki je
znašala med 90 % in 110 % (Pfaffl, 2001). Rezultati, ki prikazujejo stopnjo
izražanja genov, povezanih z imunostjo, v asimptomatski in simptomatski skupini
so podani kot relativne vrednosti.
Statistična analiza
Statistično
obdelavo in prikaz podatkov smo izvedli v programu OriginPro 2022v (Origin
Lab). Porazdelitev podatkov smo preverili s Kolmogorov-Smirnovim testom. V
primeru simetrične porazdelitve podatkov smo uporabili T-test za neodvisne
vzorce, pred tem pa preverili enakost varianc. V primeru asimetrične
porazdelitve ali neenakosti varianc podatkov smo aplicirali Mann-Whitney test.
Z zvezdicami nad stolpci na grafu smo označili statistično značilne razlike med
testiranimi skupinami (*, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001),
medtem ko lojtra (#) označuje mejno značilne spremembe (0,05 < p < 0,1).
Rezultati
Spremembe aktivnosti encimov katalaza in alfa-2-makrogobulin v hemolimfi P. scaber z bakterijsko
V
hemolimfi P. scaber s simptomatsko
bakterijsko okužbo smo opazili mejno značilno povečanje aktivnosti encima
katalaza (Sl. 3A), v primerjavi s
kontrolo. Nasprotno pa je bila aktivnost encima alfa-2-makroglobulin značilno
povečana (p < 0,01; Sl. 3B), v
primerjavi z asimptomatskimi organizmi.
Slika 3: Aktivnost encimov (A) katalaza (CAT)
in (B) alfa-2-makroglobulin (A2M) v hemolimfi asimptomatskih P. scaber in osebkih s simptomatsko
okužbo z R. porcellionis. Zvezdica
nad stolpci na grafu prikazuje statistično značilno razliko v primerjavi z
asimptomatskimi (kontrolnimi) živalmi (**; p < 0,01), medtem ko lojtra (#)
označuje mejno značilne razlike (0,05 < p < 0,1).
Figure 3: Activity of the enzymes (A) catalase (CAT) and
(B) alpha-2-macroglobulin (A2M) in the haemolymph of asymptomatic P. scaber and
individuals with symptomatic R. porcellionis infection. An asterisk above the graph
bars indicates a statistically significant difference compared to asymptomatic
(control) animals (**, p < 0.01), while a hash mark (#) indicates a
borderline significant difference (0.05 < p < 0.1)
Spremembe v izražanju genov povezanih z
imunostjo pri P. scaber s
simptomatsko bakterijsko okužbo
Okužba P.
scaber z bakterijo Rhabdochlamydia
porcellionis je izzvala spremenjeno izražanje genov, povezanih z imunostjo,
v primerjavi z asimptomatskimi, tj. zdravimi organizmi (Sl. 4). V hemocitih okuženih živali smo opazili statistično
značilno povečano izražanje genov Cat
(p < 0,05), CypG (p < 0,05), Dscam (p < 0,01), Toll4 (p < 0,05) in pa Ppae2a (p < 0,001), medtem ko za gene
Nos, A2m in Atg5 nismo zaznali
sprememb v izražanju. V primeru genov MnSod
(p= 0,082) in MyD88 (p= 0,067) pa smo
opazili mejno značilno povečano izražanje.
Slika 4: Izražanje genov povezanih z imunostjo
v hemocitih P. scaber s simptomatsko
bakterijsko (R. porcellionis) okužbo. Kontrolo predstavljajo asimptomatske
živali, tj. živali brez znakov okužbe. Podatki so predstavljeni kot relativna
sprememba v izražanju genov v primerjavi s kontrolo, povprečna vrednost ±
standardna napaka je izračunana iz treh neodvisnih vzorcev RNA. Zvezdica nad
stolpci na grafu prikazuje statistično značilno razliko v primerjavi z
asimptomatskimi (kontrolnimi) živalmi (*, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p
< 0,001), medtem ko lojtra (#) označuje mejno značilne razlike (0,05 < p
< 0,1).
Figure 4: Expression of immune-related genes in
haemocytes of P. scaber
with symptomatic bacterial (R. porcellionis) infection. Control is represented by
asymptomatic animals, i.e., animals without signs of infection. Data are
presented as relative expression change compared with control, mean ± standard
error calculated from three independent RNA samples. An asterisk above the bars
in the graph indicates a statistically significant difference compared to
asymptomatic (control) animals (*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p <
0.001), while a number sign (#) indicates a marginally significant difference
(0.05 < p < 0.1).
Diskusija
V okuženih živalih je bilo izražanje genov Toll4 in Dscam pričakovano značilno povečano. Gena namreč kodirata
evolucijsko ohranjena receptorska proteina (tj. imunski receptor; PRR),
odgovorna za prepoznavo molekularnih vzorcev patogenov oziroma mikroorganizmov
(P/MAMP) (Tran in sod., 2020; Sánchez-Salgado in sod., 2021). O podobnem
povečanem izražanju Toll in Dscam genov poročajo tudi Li in sod.
(2019) v hemocitih rakov Eriocheir
sinensis, okuženih z bakterijo Staphylococcus
aureus in pa Pan in sod. (2019), v primeru bakterijske Vibrio sp. okužbe raka Macrobrachium nipponense. Znano je, da
aktivacija Toll-u podobnih receptorjev sproži prepisovanje genov, ki sodelujejo
v protibakterijski obrambi rakov, tj. sintezi antimikrobnih peptidov (Pan in
sod., 2019), nasprotno pa aktivacija gena Dscam
promovira fagocitozo bakterij, medtem ko novejše raziskave dokazujejo udeležbo
produktov gena Dscam tudi v
regulaciji signalne poti Toll (Li in sod., 2019). Poleg povečanega izražanja
omenjenih genov smo opazili tudi mejno značilno povečanje izražanja MyD88, ki predstavlja pomemben
adaptorski protein udeležen v signalni kaskadi Toll (Habib in Zhang, 2020; Gao
in sod., 2021), kar sovpada s povečanim izražanjem Toll4. Vezava P/MAMP na plazemske oziroma PRR, vezane v membrano
hemocitov, sproži evolucijsko ohranjen proces fagocitoze, tj. požiranje tujih
delcev, npr. bakterij, ki so znotraj hemocitov uničeni in razgrajeni s strani
ROS in RNS (Raman in sod., 2008; Rodríguez-Ramos in sod., 2010). Povečano
produkcijo RNS v hemolimfi enakonožcev v primeru mikrobne okužbe smo dokazali
že v raziskavi Dolar in sod. (2020), v kateri poročamo o značilno povečani
koncentraciji dušikovega oksida (NO) v hemolimfi P. scaber s simptomatsko R.
porcellionis okužbo. Nasprotno pa v aktualni raziskavi v okuženih P. scaber nismo zaznali sprememb v
izražanju gena Nos, ki kodira encim
sintaza dušikovega oksida, odgovornega za produkcijo NO. Koncentracija
reaktivnih zvrsti (ROS in RNS) mora biti v celicah in tkivih strogo regulirana,
saj lahko povečane koncentracije trajno poškodujejo celice gostitelja. Za uravnavanje
nivoja ROS in RNS so odgovorni antioksidativni encimi (npr. CAT in SOD), ki
predstavljajo pomembno komponento prirojene imunosti rakov (Gopalakrishnan in
sod., 2011; Liu in sod., 2013). V povezavi s tem smo v hemolimfi bakterijsko
okuženih P. scaber opazili značilno
povečano izražanje gena Cat, medtem
ko je bilo izražanje gena MnSod zgolj
mejno značilno spremenjeno. Za primerjavo, v raziskavi Dolar in sod. (2020) smo
v hemolimfi bakterijsko okuženih P.
scaber izmerili značilno povečano aktivnost encima SOD, v primerjavi z
asimptomatskimi živalmi, medtem ko smo v aktualni raziskavi dodatno analizirali
tudi aktivnost encima katalaza in dokazali mejno značilno povečanje, kar
sovpada z rezultati izražanja gena Cat
v hemocitih P. scaber.
Simptomatska R. porcellionis okužba pri P.
scaber izzove aktivacijo celične komponente prirojene imunosti, kar je
jasno razvidno iz zmanjšanega deleža semigranularnih (SGC) in povečanega deleža
granularnih hemocitov (GC) v hemolimfi okuženih P. scaber (Dolar in sod., 2020). Spremenjen delež SGC lahko
razložimo z migracijo le-teh na mesto okužbe in tvorbe nodulov, o čemer
poročata že Kostanjšek in Pirc Marolt (2015), medtem ko je razlog za neznačilno
povečanje deleža GC moč iskati v proizvodnji ključnih humoralnih molekul,
vključno s komponentami sistema proPO (Herbiniѐre in sod., 2005; Tassanakajon
in sod., 2018). To sovpada z opaženim značilno povečanim izražanjem gena CypG, ki kodira regulatorni protein, za
katerega se domneva, da v granularnih hemocitih sodeluje pri ohranjanju
konformacijske celovitosti shranjenih granularnih beljakovin, s čimer je
pomembno udeležen v regulacijo sekrecije vsebine citoplazemskih granul, tj.
humoralnih molekul (Takaki in sod., 1997; Herbinière in sod., 2008). Domnevamo,
da aktivacija signalne poti Toll vodi v prepisovanje protibakterijskih genov in
sintezo humoralnih obrambnih molekul v granularnih in semigranularnih
hemocitih. Dodatno smo v simptomatskih P.
scaber opazili tudi značilno povečano izražanje gena Ppae2a, odgovornega za aktivacijo proPO sistema oziroma procesa
melanizacije (Charoensapsri in sod., 2011). Proces je namreč aktivno udeležen
pri tvorbi nodulov in se aktivira ob prisotnosti P/MAMP oziroma molekularnih
vzorcev poškodovanih celic in tkiv (t.j. DAMP) (Cerenius in Söderhäl, 2021).
Opažena sprememba v izražanju gena Ppae2a
je lahko neposredno povezana s poškodbo organizma, zaradi vdora bakterij, ali
pa gre za posledico aktivacije Toll signalne poti, s katero si proPO sistem
deli skupne regulatorne proteine (Cerenius in Söderhäll, 2021). S tem
rezultatom sovpada tudi zaznana povečana aktivnost encima alfa-2-makroglobulin,
ki predstavlja pomembno serinsko proteazo, odgovorno za regulacijo proPO
sistema in procesa melanizacije (Ponprateep in sod., 2017).
Zaključki
Na podlagi rezultatov lahko nedvomno
zaključimo, da simptomatska bakterijska okužba P. scaber z R. porcellionis
izzove značilne spremembe v izražanju izbranih kandidatnih genov. Rezultati
potrjujejo pomembno vlogo analiziranih genov v imunskem odgovoru v primeru
mikrobne okužbe. Hkrati pa preučevani geni, povezani z imunostjo, predstavljajo
potencialne biološke označevalce v okoljskih raziskavah.
Prispevek avtorjev
Conceptualization, AD; methodology, AD, JO;
software, AD; validation, AD, JO, AJK; formal analysis, AD; investigation, AD;
data curation, AD; writing—original draft preparation, AD; writing—review and
editing, JO, AJK; funding acquisition, AJK. All authors have read and agreed to
the published version of the manuscript.
Zahvala
Raziskovalno delo predstavljeno v prispevku je bilo
financirano s strani javne agencije za znanstvenoraziskovalno in inovacijsko
dejavnost Republike Slovenije (ARIS), v okviru raziskovalnega programa
Integrativna zoologija in speleobiologija (P1-0184), projekta (J1-2482) in
pogodbe sklenjene z Univerzo v Ljubljani, Biotehniško fakulteto, za
usposabljanje mladega raziskovalca (Andraž Dolar).
Konflikt interesov
Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja
interesov.
Literatura
Amparyup, P., Charoensapsri, W.,
Tassanakajon, A., 2013. Prophenoloxidase system and its role in shrimp immune
responses against major pathogens. Fish & Shellfish Immunology, 34 (4),
990-1001. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2012.08.019
Becking, T., Giraud, I., Raimond, M.,
Moumen, B., Chandler, C., Cordaux, R., Gilbert, C., 2017. Diversity and
evolution of sex determination systems in terrestrial isopods. Scientific
Reports, 7 (1), 1084. https://doi.org/10.1038/s41598-017-01195-4
Cerenius, L., Söderhäll, K., 2021.
Immune properties of invertebrate phenoloxidases. Developmental &
Comparative Immunology, 122, 104098. https://doi.org/10.1016/j.dci.2021.104098
Charoensapsri, W., Amparyup, P., Hirono,
I., Aoki, T., Tassanakajon, A., 2011. PmPPAE2, a new class of crustacean
prophenoloxidase (proPO)-activating enzyme and its role in PO activation.
Developmental & Comparative Immunology, 35 (1), 115-124. https://doi.org/10.1016/j.dci.2010.09.002
Chevalier, F., Herbiniére-Gaboreau, J.,
Bertaux, J., Raimond, M., Morel, F., Bouchon, … Braquart-Varnier, C., 2011. The
immune cellular effectors of terrestrial isopod Armadillidium vulgare: meeting with their invaders, Wolbachia. PLoS
One, 6 (4), e18531. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0018531
Chevalier, F., Herbinière-Gaboreau, J.,
Charif, D., Mitta, G., Gavory, F., Wincker, P., … Bouchon, D., 2012. Feminizing
Wolbachia: a transcriptomics approach with insights on the immune response
genes in Armadillidium vulgare. BMC
microbiology, 12, 1-18. https://doi.org/10.1186/1471-2180-12-S1-S1
Clark, K.F., Greenwood, S. J., 2016.
Next-generation sequencing and the crustacean immune system: the need for
alternatives in immune gene annotation. Integrative and comparative biology, 56
(6), 1113-1130. https://doi.org/10.1093/icb/icw023
Cole, A., Morris, J., 1980. A new
iridovirus of two species of terrestrial isopods, Armadillidium vulgare and Porcellio
scaber. Intervirology, 14 (1), 21-30. https://doi.org/10.1159/000149158
Dolar, A., Mayall, C., Drobne, D.,
Kokalj, A. J., 2020. Modulations of immune parameters caused by bacterial and
viral infections in the terrestrial crustacean Porcellio scaber: Implications for potential markers in
environmental research. Developmental & Comparative Immunology, 113,
103789. https://doi.org/10.1016/j.dci.2020.103789
Dolar, A., Selonen, S., van Gestel, C.
A., Perc, V., Drobne, D., Jemec Kokalj, A., 2021. Microplastics, chlorpyrifos
and their mixtures modulate immune processes in the terrestrial crustacean Porcellio scaber. Science of the Total
Environment, 772, 144900. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.144900
Dolar, A., Jemec Kokalj, A., Drobne, D.,
2022a. Time-course of the innate immune response of the terrestrial crustacean Porcellio scaber after injection of a
single dose of lipopolysaccharide. Frontiers in Immunology, 13, 867077. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.867077
Dolar, A., Drobne, D., Dolenec, M.,
Marinšek, M., Jemec Kokalj, A., 2022b. Time-dependent immune response in Porcellio scaber following exposure to
microplastics and natural particles. Science of The Total Environment, 818,
151816. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2021.151816
Dolar, A., Drobne, D., Narat, M., Jemec
Kokalj, A., 2022c. Tire microplastics exposure in soil induces changes in
expression profile of immune-related genes in terrestrial crustacean Porcellio scaber. Environmental
Pollution, 314, 120233. https://doi.org/10.1016/j.envpol.2022.120233
Dolar, A., Močivnik, L., Manzano, M. A.,
Hrga, N., Zakšek, V., Jemec Kokalj, A., … Kostanjšek, R., 2022d. RNA-Seq data
of common woodlice Porcellio scaber.
Zenodo. https://doi.org/10.5281/zenodo.6673325
Esteve, M., Herrera, F. C., 2000.
Hepatopancreatic alterations in Litopenaeus
vannamei (Boone, 1939) (Crustacea: Decapoda: Penaeidae) experimentally
infected with a Vibrio alginolyticus
strain. Journal of invertebrate pathology, 76 (1), 1-5. https://doi.org/10.1006/jipa.2000.4951
Gao, Q., Tang, Q., Xia, Z., Yi, S., Cai,
M., Du, H., … Yang, G., 2021. Molecular identification and functional analysis
of MyD88 in giant freshwater prawn (Macrobrachium
rosenbergii) and expression changes in response to bacterial challenge.
International Journal of Biological Macromolecules, 178, 492-503. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2021.02.177
Gopalakrishnan, S., Chen, F. Y.,
Thilagam, H., Qiao, K., Xu, W. F., Wang, K. J., 2011. Modulation and
interaction of immune-associated parameters with antioxidant in the immunocytes
of crab Scylla paramamosain
challenged with lipopolysaccharides. Evidence-Based Complementary and
Alternative Medicine, 2011, 824962. https://doi.org/10.1155/2011/824962
Habib, Y. J., Zhang, Z., 2020. The
involvement of crustaceans toll-like receptors in pathogen recognition. Fish
& shellfish immunology, 102, 169-176. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2020.04.035
Halter, T., Köstlbacher, S., Collingro,
A., Sixt, B. S., Tönshoff, E. R., Hendrickx, F., … Horn, M., 2022. Ecology and
evolution of chlamydial symbionts of arthropods. ISME Communications, 2 (1),
45. https://doi.org/10.1038/s43705-022-00124-5
Herbinière, J., Braquart-Varnier, C.,
Grève, P., Strub, J. M., Frère, J., Van Dorsselaer, A., Martin, G., 2005.
Armadillidin: a novel glycine-rich antibacterial peptide directed against
gram-positive bacteria in the woodlouse Armadillidium
vulgare (Terrestrial Isopod, Crustacean). Developmental & Comparative
Immunology, 29 (6), 489-499. https://doi.org/10.1016/j.dci.2004.11.001
Herbinière, J., Grève, P., Strub, J. M.,
Thiersé, D., Raimond, M., van Dorsselaer, A., … Braquart-Varnier, C., 2008.
Protein profiling of hemocytes from the terrestrial crustacean Armadillidium vulgare. Developmental
& Comparative Immunology, 32 (8), 875-882. https://doi.org/10.1016/j.dci.2008.01.007
Hornung, E., Farkas., S., Fischer., E.,
1998. Tests on the isopod Porcellio
scaber. In: Løkke H., van Gestel C.A.M. (eds.) Handbook of soil
invertebrate toxicity tests, John Wiley & Sons Ltd, 207-226.
Hornung, E., 2011. Evolutionary
adaptation of oniscidean isopods to terrestrial life: structure, physiology and
behavior. Terrestrial Arthropod Reviews, 4 (2), 95-130.
Jemec Kokalj, A., Dolar, A., Titova, J.,
Visnapuu, M., Škrlep, L., Drobne, D., … Heinlaan, M., 2021. Long term exposure
to virgin and recycled LDPE microplastics induced minor effects in the
freshwater and terrestrial Crustaceans Daphnia
magna and Porcellio scaber.
Polymers, 13 (5), 771. https://doi.org/10.3390/polym13050771
Jemec Kokalj, A., Dolar, A., Drobne, D.,
Škrlep, L., Škapin, A.S., Marolt, G., … van Gestel C.A., 2022. Effects of
microplastics from disposable medical masks on terrestrial invertebrates.
Journal of hazardous materials, 438, 129440. https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2022.129440
Jiravanichpaisal, P., Lee, B. L.,
Söderhäll, K., 2006. Cell-mediated immunity in arthropods: hematopoiesis,
coagulation, melanization and opsonization. Immunobiology, 211 (4), 213-236. https://doi.org/10.1016/j.imbio.2005.10.015
Kostanjšek, R., Štrus, J., Drobne, D.,
Avguštin, G., 2004. ‘Candidatus Rhabdochlamydia
porcellionis’, an intracellular bacterium from the hepatopancreas of the
terrestrial isopod Porcellio scaber
(Crustacea: Isopoda). International journal of systematic and evolutionary
microbiology, 54 (2), 543-549. https://doi.org/10.1099/ijs.0.02802-0
Kostanjšek, R., Marolt, T. P., 2015.
Pathogenesis, tissue distribution and host response to Rhabdochlamydia porcellionis infection in rough woodlouse Porcellio scaber. Journal of
invertebrate pathology, 125, 56-67. https://doi.org/10.1016/j.jip.2015.01.001
Li, D., Wan, Z., Li, X., Duan, M., Yang,
L., Ruan, Z., … Li, W., 2019. Alternatively spliced down syndrome cell adhesion
molecule (Dscam) controls innate immunity in crab. Journal of Biological
Chemistry, 294 (44), 16440-16450. https://doi.org/10.1074/jbc.RA119.010247
Liu, Y. T., Chang, C. I., Hseu, J. R.,
Liu, K. F., Tsai, J. M., 2013. Immune responses of prophenoloxidase and
cytosolic manganese superoxide dismutase in the freshwater crayfish Cherax quadricarinatus against a virus
and bacterium. Molecular Immunology, 56 (1-2), 72-80. https://doi.org/10.1016/j.molimm.2013.03.023
Liu, Q. N., Tang, Y. Y., Zhang, S. P.,
Li, Y. T., Wang, G., Zhang, D. Z., Jiang, S-H., Yang, H., Tang, B-P., Dai, L.
S., 2022. Characterization and expression analysis of differentially expressed
genes in the red swamp crayfish Procambarus
clarkii in response to Vibrio
cholerae challenge. Aquaculture, 547, 737435. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.737435
Lou, F., Wang, Y., Han, Z., Shui, B.,
2022. Comparative transcriptome reveals the molecular regulation mechanism of Charybdis japonica to high-and
low-temperature stresses. Frontiers in Marine Science, 9, 849485. https://doi.org/10.3389/fmars.2022.849485
Mengal, K., Kor, G., Kozák, P.,
Niksirat, H., 2022. Effects of environmental factors on the cellular and
molecular parameters of the immune system in decapods. Comparative Biochemistry
and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 276, 111332. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2022.111332
Pan, L., Zhang, X., Yang, L., Pan, S.,
2019. Effects of Vibro harveyi and Staphyloccocus aureus infection on
hemocyanin synthesis and innate immune responses in white shrimp Litopenaeus vannamei. Fish &
Shellfish Immunology, 93, 659-668. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.08.016
Pfaffl, M.W., 2001. A new mathematical
model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic acids research,
29 (9), e45-e45. https://doi.org/10.1093/nar/29.9.e45
Ponprateep, S., Vatanavicharn, T., Lo,
C. F., Tassanakajon, A., Rimphanitchayakit, V., 2017. Alpha-2-macroglobulin is
a modulator of prophenoloxidase system in pacific white shrimp Litopenaeus vannamai. Fish &
shellfish immunology, 62, 68-74. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2016.12.028
Raman, T., Arumugam, M., Mullainadhan,
P., 2008. Agglutinin-mediated phagocytosis-associated generation of superoxide
anion and nitric oxide by the hemocytes of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Fish &
Shellfish Immunology, 24 (3), 337-345. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2007.12.005
Rodríguez-Ramos, T., Carpio, Y.,
Bolívar, J., Espinosa, G., Hernández-López, J., Gollas-Galván, T., … Estrada,
M. P., 2010. An inducible nitric oxide synthase (NOS) is expressed in hemocytes
of the spiny lobster Panulirus argus:
cloning, characterization and expression analysis. Fish & shellfish
immunology, 29 (3), 469-479. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2010.05.013
Sánchez-Salgado, J. L., Pereyra, M. A.,
Agundis, C., Calzada-Ruiz, M., Kantun-Briceño, E., Zenteno, E., 2019. In vivo administration of LPS and
β-glucan generates the expression of a serum lectin and its cellular receptor
in Cherax quadricarinatus. Fish &
Shellfish Immunology, 94, 10-16. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2019.08.061
Sánchez-Salgado, J. L., Pereyra, M. A.,
Alpuche-Osorno, J. J., Zenteno, E., 2021. Pattern recognition receptors in the
crustacean immune response against bacterial infections. Aquaculture, 532,
735998. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2020.735998
Söderhäll, I., 2016. Crustacean
hematopoiesis. Developmental & Comparative Immunology, 58, 129-141. https://doi.org/10.1016/j.dci.2015.12.009
Sun, M., Li, S., Zhang, X., Xiang, J.,
Li, F., 2020. Isolation and transcriptome analysis of three subpopulations of
shrimp hemocytes reveals the underlying mechanism of their immune functions.
Developmental & Comparative Immunology, 108, 103689. https://doi.org/10.1016/j.dci.2020.103689
Sun, Y., Zhang, X., Wang, Y., Zhang, Z.,
2022. Long-read RNA sequencing of Pacific abalone Haliotis discus hannai reveals innate immune system responses to
environmental stress. Fish & Shellfish Immunology, 122, 131-145. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2022.01.042
Takaki, Y., Muta, T., Iwanaga, S., 1997.
A peptidyl-prolyl cis/trans-isomerase (cyclophilin G) in regulated secretory
granules. Journal of Biological Chemistry, 272 (45), 28615-28621. https://doi.org/10.1074/jbc.272.45.28615
Tassanakajon, A., Somboonwiwat, K.,
Supungul, P., Tang, S., 2013. Discovery of immune molecules and their crucial
functions in shrimp immunity. Fish & shellfish immunology, 34 (4), 954-967.
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2012.09.021
Tassanakajon, A., Rimphanitchayakit, V.,
Visetnan, S., Amparyup, P., Somboonwiwat, K., Charoensapsri, W., Tang, S.,
2018. Shrimp humoral responses against pathogens: antimicrobial peptides and
melanization. Developmental & Comparative Immunology, 80, 81-93. https://doi.org/10.1016/j.dci.2017.05.009
Tran, N. T., Kong, T., Zhang, M., Li,
S., 2020. Pattern recognition receptors and their roles on the innate immune
system of mud crab (Scylla paramamosain).
Developmental & Comparative Immunology, 102, 103469. https://doi.org/10.1016/j.dci.2019.103469
Van Gestel, C.A., Loureiro, S., Zidar,
P., 2018. Terrestrial isopods as model organisms in soil ecotoxicology: a
review. ZooKeys, 801, 127-162. https://doi.org/10.3897/zookeys.801.21970
Wang, W., 2011. Bacterial diseases of
crabs: a review. Journal of invertebrate pathology, 106 (1), 18-26. https://doi.org/10.1016/j.jip.2010.09.018
Wang, X. W., Wang, J. X., 2013. Pattern
recognition receptors acting in innate immune system of shrimp against pathogen
infections. Fish & shellfish immunology, 34 (4), 981-989. https://doi.org/10.1016/j.fsi.2012.08.008
Xu, Z., Liu, A., Li, S., Wang, G., Ye,
H., 2020. Hepatopancreas immune response during molt cycle in the mud crab, Scylla paramamosain. Scientific Reports,
10 (1), 13102. https://doi.org/10.1038/s41598-020-70139-2